Production of L-methioninase enzyme, investigation of its anticarcinogenic properties and usage areas in the food industry

Basit Öğe Kaydı
dc.contributor.advisorGöktürk, Dilek
dc.contributor.authorİpek, Semih Latif
dc.date.accessioned2025-01-06T17:11:50Z
dc.date.available2025-01-06T17:11:50Z
dc.date.issued2023
dc.departmentEnstitüler, Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
dc.descriptionFen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
dc.description.abstractBu çalışmada L-metiyoninaz enzimi, yardımcı peynir kültürü olan Brevibacterium linens BL2'den kısmen saflaştırılmıştır. Enzimin spesifik aktivitesi 3.055 ünite/mg olarak belirlenmiştir. İlk olarak, L-metiyoninazın Glioblastoma hücrelerine olan sitotoksik etkileri değerlendirilmiştir. U87MG ve T98G glioblastoma hücre hatlarının IC50 değerleri, 24 saatlik inkübasyon sonrası nötral kırmızı canlılık analizi ile sırasıyla 5.792 ünite/mL ve 5.215 ünite/mL olarak saptanmıştır. L-metiyoninaz, etoposid ile birlikte kombinasyon halinde kullanıldığında aynı hücre hatlarına karşı sitotoksik etkiyi de artırdığı görülmüştür. Bu, U87MG hücrelerinin canlılığında önemli bir azalmaya yol açmış ve 48 saatlik inkübasyon süresinde kontrol grubuyla karşılaştırıldığında canlılığı %24.35'e azalttığı gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, T98G hücrelerinin büyümesi hem L-metiyoninaz hem de etoposid tarafından inhibe edilmiştir. 48 saatlik inkübasyon sonunda hücresel canlılık, kontrol gruba kıyasla %37.74'e düşüş göstermiştir. Brevibacterium linens BL2'den saflaştırılan L-metiyoninaz enzimi Fare Embriyonik Fibroblast (MEF) hücreleri ve İnsan Keratinosit Hücre Hattı (HaCaT) üzerinde glioblastoma hücrelerine göre daha düşük sitotoksik etki göstermiştir. L-metiyoninaz ve etoposidin kombinasyon uygulaması, HaCaT hücre canlılığının genel olarak %63.02'ye ve MEF hücre canlılığının %58.99'a düşürmüştür. Giemsa, DAPI ve F-aktin boyama yöntemleri ile hem hücre popülasyonunda hem de morfolojideki değişiklikleri doğrudan tespit edilmiştir. L-metiyoninaz ve etoposidin birlikte uygulanması, glioblastomanın yara iyileştirme yeteneğini azaltmasının yanında, hücresel göçün baskılanmasında dikkate değer bir etkinlik gösterdiği gözlemlenmiştir. Klonojenik deneyler, L-metiyoninaz ve etoposid uygulanmasının, 21 günlük inkübasyon süresi boyunca glioblastoma hücrelerinin koloni sayısında önemli bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir. RT-qPCR sonuçları, L-metiyoninazın, kanser hücrelerinin hayatta kalması için hayati olan Survivin ve C-Myc genlerinin ekspresyonunda azalmaya neden olurken hücre ölümü için gerekli olan Kaspaz-3 geninin ekspresyonunu arttırdığını göstermektedir. Bu araştırma aynı zamanda L-metiyoninazın çedar peyniri bulamaçlarına uygulanmasının uçucu sülfür bileşikleri üretimi ve peynir mikrobiyomu değişimi üzerindeki etkileri de araştırılmıştır. Çedar bulamacı numuneleri, yeni nesil dizileme ve GC-MS analizi kullanılarak incelenmiştir. Deneyin ilk gününde numunelerde çoğunlukla Lactococcus ve Streptococcus suşlarının baskın olduğu görülmüştür. Ancak, dokuzuncu günde, tüm örneklerde belirgin bir şekilde Limosilactobacillus, Lactobacillus, Enterococcus ve Lacticaseibacillus gibi mikroorganizmaların varlığı ile karakterize edilen mikrobiyal çeşitlilikte kayda değer bir artış gözlenmiştir. İlginç bir şekilde, Lactococcus ve Streptococcus, dokuzuncu günde hala baskın türler olarak kalmıştır. Ek olarak, L-metiyoninaz enzimi ve Brevibacterium linens BL2'nin ilave edilmesi, Metanetiyol ve Dimetil trisülfür gibi uçucu kükürt bileşiklerinin üretimini teşvik etmiştir. Fermantasyonun erken aşamasında, L-metiyoninaz enzimi çedar bulamaçlarında 1490.2 ± 1.31 (µg/kg kuru madde) metanetiyol ve 65.8 ± 0.04 (µg/kg kuru madde) dimetil trisülfit üretmiştir. Bu sonuçlar, L-metiyoninazın çedar peyniri üretiminde ekonomik değer arttırıcı potansiyele sahip bir gıda endüstrisi enzimi olarak gelecekte kullanılabileceği görüşünü desteklemektedir.
dc.description.abstractIn this study, L-methioninase was partially purified from Brevibacterium linens BL2. The specific activity of this enzyme was 3.055 units/mg. The cytotoxic properties of L-methioninase against Glioblastoma cells were evaluated. The IC50 values of U87MG and T98G glioblastoma cell lines were found to be 5.792 units/mL and 5.215 units/mL, respectively, using a neutral red viability assay after 24 h of incubation. L-methioninase also increased the cytotoxic effect of etoposide in the same cell lines when combined. This led to a notable decrease in the viability of U87MG cells, with only 24.35% remaining compared with the control group after 48 h of incubation. Similarly, the growth of T98G cells was inhibited by both L-methioninase and etoposide compared to the control group. Following After 48-hour phase of incubation, the cellular viability decreased by 37.74% compared to that of the untreated group. Notably, the cytotoxic effects of the L-methioninase enzyme produced by Brevibacterium linens on Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) cells and Human Keratinocyte Cell Line (HaCaT) cells, however, were found to be lower than those of etoposide. The combined administration of L-methioninase and etoposide resulted in an overall decrease in HaCaT cell viability to 63.02% and MEF cell viability to 58.99%. The use of staining methods such as Giemsa staining, DAPI staining, and F-actin staining enabled the direct detection of alterations in both cell population and morphology. The co-administration of L-methioninase and etoposide showed notable effectiveness in suppressing cellular migration, as evidenced by the results of a wound healing experiment. In a clonogenic experiment, the administration of L-methioninase and etoposide led to a significant decrease in the number of colonies observed throughout the 21-day incubation period. According to the RT-qPCR results, L-methioninase caused a decrease in the expression of c-Myc and survivin genes, while simultaneously increasing the expression of Caspase-3. This study also investigated the effects of applying L-methioninase to cheddar cheese slurries on the production of volatile sulfur compounds and cheese microbiome alteration. The cheddar slurry samples were analyzed using next-generation sequencing and GC-MS analysis. On the first day of the experiment, the samples were mostly dominated by Lactococcus and Streptococcus strains. On the ninth day, a notable augmentation in microbial diversity was found in all samples, characterized by the presence of Limosilactobacillus, Lactobacillus, Enterococcus, and Lacticaseibacillus in considerable quantities across all samples. Lactococcus and Streptococcus were the predominant species. The introduction of L-methioninase and Brevibacterium linens BL2 led to the formation of volatile sulfur compounds, namely, Methanethiol and Dimethyl trisulfide. During the first stage of fermentation, the L-methioninase enzyme generated a quantity of 1490.2 ± 1.31 (µg/kg dry matter) of Methanethiol and 65.8 ± 0.04 (µg/kg dry matter) of Dimethyl trisulfide inside the cheddar slurry. The present study provides evidence supporting the possibility of L-methioninase as a promising option for food enzymes in cheddar cheese manufacturing, thus presenting substantial economic benefits.
dc.identifier.endpage161
dc.identifier.startpage1
dc.identifier.urihttps://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/TezGoster?key=S2eMu1TIwY_v4mYv58xAr4eTJ1cRiUruDpDQyXyMG-lUnFpwNrmujJbIRqnfwc4_
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/20.500.14669/177
dc.identifier.yoktezid838357
dc.language.isoen
dc.publisherAdana Alparslan Türkeş Bilim ve Teknoloji Üniversitesi
dc.relation.publicationcategoryTez
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.snmzKA_20241211
dc.subjectBiyoteknoloji
dc.subjectBiotechnology ; Genetik
dc.titleProduction of L-methioninase enzyme, investigation of its anticarcinogenic properties and usage areas in the food industry
dc.title.alternativeL-metiyoninaz enziminin üretimi, anti-kanserojen özelliklerinin ve gıda endüstrisinde kullanım olanaklarının araştırılması
dc.typeDoctoral Thesis

Dosyalar

Koleksiyon

Lisansüstü Eğitim Enstitüsü Tez Koleksiyonu