Chitosan scaffolds containing boron compound for bone tissue engineering

In this study, scaffolds produced with sodium pentaborate pentahydrate (SPP) containing chitosan (Ch) and medical grade (MG) chitosan were obtained by freeze drying method, characterization studies were performed and cell culture studies were carried out to determine their potential in bone tissue engineering applications. SPP was added to the chitosan polymer solution dissolved in 1% (v/v) acetic acid at ratios of 0.125%, 0.25%, 0.5%, 0.75% and 1% (w/w). In order to obtain a 3-dimensional pore structure, the polymer was frozen at -20 oC for 2 days and freeze dried at -80 oC in and tey were stabilized by ethanol or NaOH and freeze dried again. Three different experimental groups were studied in the thesis: free SPP dissolved in cell culture medium, chitosan scaffolds containing SPP at concentrations ranging from 0.125% to 1% (w/w), and medical-grade chitosan scaffolds containing 0.5% and 0.75% (w/w) SPP. Scanning Electron Microscopy (SEM) and ImageJ analysis of the studies with chitosan (Ch) polymer showed that increasing SPP concentration decreased the average pore size. The smallest pore structure was observed in the scaffold containing 1% SPP. Water retention tests revealed that all scaffolds reached swelling equilibrium within 30 minutes, but the swelling capacity decreased as the SPP concentration increased. The highest water uptake capacity was measured in the pure chitosan scaffold and the lowest in the scaffold containing 1% SPP. Four-week biodegradation tests showed greater weight loss in scaffolds with higher SPP content. When the antimicrobial properties of Ch – SPP scaffolds were examined, it was determined that Ch - SPP scaffolds showed a dose-dependent antifungal effect against Aspergillus niger and Candida albicans. When MC3T3-E1 mouse osteoblast cells were cultured on the scaffolds, it was observed that cell viability decreased in all groups in the following days. Considering that cell proliferation was not supported by Ch-SPP scaffolds, the effect of both chitosan type and stabilization method on the proliferation of MC3T3-E1 cells was examined. The results showed that the scaffolds produced with medical grade chitosan (MG) and stabilized with NaOH promoted the proliferation of MC3T3-E1 cells. Therefore, in the ongoing studies, scaffolds containing 0.5%, 0.75% (w/w) SPP with medical grade chitosan were produced, characterized and cell culture studies were carried out. Resazurin viability assay results showed that MCET3-E1 cells adhered to the scaffolds and supported their proliferation. Although metabolic activity decreased in the last days, DAPI staining results revealed increased cell nuclei density at day 10, especially in the MG Ch - 0.5 SPP and MG Ch - 0.75 SPP groups, indicating that cell proliferation supported. SEM analysis results also showed that the cells proliferated and spread intensively, especially in the MG Ch - 0.5 SPP group. In conclusion, SPP-enriched medical grade chitosan scaffolds were found to be antifungal and biocompatible by supporting the proliferation of MC3T3-E1 cells. Among all formulations, the scaffold containing 0.5% (w/w) SPP in NaOH-stabilized medical grade chitosan stands out as the most promising scaffold for bone tissue engineering.

Bu çalışmada, sodyum pentaborat pentahidrat (SPP) içeren kitosan (Ch) ve tıbbi kullanıma uygun (MG) kitosan ile üretilen iskeleler dondurarak kurutma yöntemi ile elde edilmiş, karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve kemik doku mühendisliği uygulamalarındaki potansiyellerini belirlemek amacı ile hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. SPP %1 (v/v) asetik asitte çözünmüş kitosan polimer çözeltisine, %0.125, %0.25, %0.5, %0.75 ve %1 (w/w) oranlarında eklenmiştir. 3 boyutlu gözenek yapısı elde edebilmek için 2 gün -20 oC'de dondurulan polimer -80 oC dondurarak kurutma cihazında kurutulmuş buradan elde edilen iskeleler etanol veya NaOH ile stabilize edilip tekrar dondurarak kurutma cihazında kurutulmuştur. Tez çalışmasında üç farklı deney grubu ile çalışılmıştır: hücre kültür ortamında çözürülen iskelesiz serbest SPP, %0,125 ila %1 (a/a) konsantrasyonlarda SPP içeren kitosan iskeleler ve %0,5 ve %0,75 (a/a) SPP içeren tıbbi sınıf kitosan iskeleler. Kitosan (Ch) polimeri ile yapılan çalışmalarda taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve ImageJ analizleri, artan SPP konsantrasyonunun ortalama gözenek boyutunu azalttığını göstermiştir. En küçük gözenek yapısı %1 SPP içeren iskelede gözlemlenmiştir. Su tutma testleri, tüm iskelelerin 30 dakika içinde şişme dengesine ulaştığını, ancak SPP konsantrasyonu arttıkça şişme kapasitesinin azaldığını ortaya koymuştur. En yüksek su tutma kapasitesi saf kitosan iskelede, en düşük ise %1 SPP içeren iskelede ölçülmüştür. Dört haftalık biyobozunma testleri, yüksek SPP içeriğine sahip iskelelerde daha fazla ağırlık kaybı olduğunu göstermiştir. Ch – SPP iskelelerin antimikrobiyal özellikleri incelendiğinde Aspergillus niger and Candida albicans'a karşı doza bağlı olarak antifungal etki gösterdiği belirlenmiştir. MC3T3-E1 fare osteoblast hücreleri iskeleler üzerinde kültüre edildiğinde hücre canlılığının tüm gruplarda ilerleyen günlerde azaldığı görülmüştür. Hücre üremesinin Ch – SPP isekeleler tarafından desteklenmediği düşünülerek hem kitosan çeşidi hem de stabilizasyon yönteminin hücre çoğalması üzerine etkisi incelenmiştir. Sonuçlar, tıbbi kullanıma uygun kitosan (MG) ile üretilen ve NaOH ile stabilize edilen iskelelerin MC3T3-E1 hücrelerinin çoğalmasını desteklediğini göstermiştir. Bu nedenle devam eden çalışmalarda tıbbi kullanıma uygun kitosan ile %0.5, %0.75 (w/w) oranında SPP içeren iskeleler üretilmiş, karakterize edilmiş ve hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Resazurin canlılık analizi sonuçları MCET3-E1 hücrelerinin iskeleler üzerine tutunduğunu ve çoğalmalarını desteklediğini göstermiştir. Metabolik aktivite son günlerde düşüş gösterse de, DAPI boyama sonuçları, özellikle %0.5 ve %0.75 SPP gruplarında 10. günde artan hücre çekirdeği yoğunluğunu ortaya koymuş, bu da hücre çoğalmasının devam ettiğini göstermiştir. SEM analizi sonuçlarında da özellikle MG Ch - 0.5 SPP grubunda hücrelerin yoğun bir şekilde çoğaldığı ve yayıldığı görülmüştür. Sonuç olarak, SPP ile zenginleştirilmiş tıbbi kullanıma uygun kitosan iskelelerin antifungal özellik gösterdiği, MC3T3-E1 hücrelerinin çoğalmasını destekleyerek biyouyumlu olduğu belirlenmiştir. Tüm formülasyonlar arasında, NaOH ile stabilize edilmiş tıbbi kullanıma uygun kitosan içinde %0.5 (w/w) SPP içeren iskele, kemik doku mühendisliği için en umut verici yapı olarak öne çıkmaktadır.